Дифференциально диагностические среды для кишечных инфекций

Основным методом
лабораторной диагностики кишечных
инфекций является бактериологический,
основанный на выделении чистой культуры
возбудителя и ее идентификации. Для
идентификации бактерий кишечной группы
ис­пользуют изучение их ферментативной
активности и антигенной структуры.

Выделение чистой культуры

В природе бактерии чистыми культурами не живут. В ста случаях из ста они обитают микробными сообществами, которым присуще функциональное разделение ролей. Одни микроорганизмы дают пищу другим, третьи создают условия для существования четвертых и так далее. Такой принцип общежития, увеличивающий жизнеспособность бактерий в окружающей среде, создает определенную трудность для исследователя: необходимость выделения чистой культуры из бактериального сообщества для ее предметного изучения.

Сегодня микробиология использует следующие способы выделения чистых культур:

  1. Метод Дригальского используется для выделения аэробов (кислорододышащих микроорганизмов). Проводится в несколько этапов, на каждом из которых исследуемое бактериальное сообщество разделяется на более мелкие сообщества. Изучается их рост и характер развития до выделения чистой культуры.
  2. Метод Коха, при котором для выделения чистых культур используется бактериологическая петля и полурасплавленный агар-агар. Внутрь вязкого агар-агара бактериологической петлей поселяют колонию, при этом хорошенько размешивают ее по всей поверхности. После того, как агар-агар застывает, делают еще три-четыре разведения, материал для которого берется в каждой новой партии. К последнему разведению в агар-агаре содержится уже минимальное количество бактерий, пригодных для выделения. Изолированную колонию переселяют на свежую питательную среду.
  3. Метод Вейнберга. Применяется для выделения анаэробных микроорганизмов. Используется с применением анаэростата. Бактерий разводят по методу Коха 6-7 раз, после каждого разведения отправляют в анаэростат. Последнюю пробирку со средой и с бактериальной колонией быстро охлаждают и заливают парафином с вазелиновым маслом, которые перекрывают доступ кислорода в пробирку. В результате колония анаэробных микроорганизмов растет под наблюдением исследователя, который всегда может изучить поселение в пробирке и определить рост колонии, а также характер ее развития.

Внешне чистая культура представляет собой однородный обособленный нарост на питательной среде для бактерий. Такие иногда можно увидеть на испорченных продуктах питания. Считается, что именно в одном таком обособленном наросте обитают бактерии, произошедшие из одной бактериальной клетки.

Читайте также:  Атопический дерматит у собак

Микробиология за свою историю изобрела много способов для выделения чистых бактериальных культуры. Многие из них невозможно использовать в домашних условиях. И это при том, что даже для использования простых способов выделения чистых культур исследователю придется приобретать определенное количество лабораторных приспособлений. Но если простые чашки Петри, трубки Бурри и тот же анаэростат приобрести вполне по силам, то многие другие лабораторные установки требуют капитальных финансовых вложений.

Этапы бактериологического исследования

1 день. Посев исследуемых материалов на дифференциально-диагностические среды (Эндо, Плоскирева, Левина).

Для выделения гемокультуры сальмонелл производят посев крови на 10-20% желчный бульон или на среду Рапопорт. Соотношение крови и среды должно составлять 1:10. Инкубация 18-24 часа при температуре 37ºС

2 день. Просмотр и описание колоний. Микроскопия материала из колоний и окраска по Граму. Пересев материала из колоний на скошенный МПА, среду Ресселя для накопления чистой культуры. Со среды Рапопорт культуру пересевают на среду Эндо и Ресселя.

В случае диффузного помутнения и изменения цвета среды Рапопорта (она приобретает красный цвет) за счет ферментации глюкозы с образованием кислоты делают предварительный вывод о наличии возбудителей брюшного тифа; при наличии кроме этих признаков газообразования в поплавке — возбудителей паратифов.

Постановка ориентировочной реакции агглюцинации на стекле с материалом из отдельных колоний и смесью эшерихиозных сывороток, со смесью дизентерийных сывороток, со смесью сывороток против сальмонелл, содержащих антитела против наиболее распространенных сероваров возбудителей кишечных инфекций. При положительном результате проводят реакцию агглютинации с моновалентными агглютинирующими сыворотками на стекле.

3 день. Проверка чистоты выделенной культуры. Учет изменения цвета среды Ресселя. Постановка с чистыми культурами реакции агглютинации на стекле с поливалентными сыворотками, затем с видовыми и типовыми сыворотками. Постановка развернутой реакции агглютинации. Пересев культур на среды для определения ферментативной активности (среды Гисса).

4 день. Учет результатов реакции агглютинации.

Учет роста на средах Гисса.

Окончательный ответ о виде и сероваре дают на основании результатов реакции агглютинации и «пестрого» ряда.

Возбудители эшерихиозов ферментируют глюкозу и лактозу с образованием кислоты и газа, выделяют сероводород.

Шигеллы ферментируют углеводы с образованием кислоты. Возбудители сальмонеллезов не ферментируют лактозу и сахарозу, расщепляют глюкозу маннит и мальтозу с образованием кислоты и газа, не образуют индол и за неболь­шим исключением выделяют сероводород.

Дифференциально-диагностическая таблица кишечно-тифозной группы

Название бактерий

Углеводы

Индол

Подвижность

Экзотоксин

Лактоза

Глюкоза

Мальтоза

Маннит

Сахароза

Кишечная палочка

кг

кг

кг

кг

кг или –

+

Паратифозная

В-палочка

кг

кг

кг

+

Паратифозная

А-палочка

кг

кг

кг

+

Брюшнотифозная палочка

к

к

к

+

Дизентерийная палочка

Григорьева-Шига

к

+

Дизентерийная палочка

Флекснера

к

к или –

к или –

к или –

Дизентерийная палочка

Зонне

к (2-10 суток)

к

к или –

к

к

Читайте также:  Почему отекают ноги и как снять отек в домашних условиях?

Как работают хромогенные питательные среды?

Рассмотрим принцип работы хромогенных питательных сред на примере хромогенного агара для Enterobactersakazakii (ENTEROBACTER SAKAZAKII ISOLATION CHROMOGENIC AGAR (ESIA) ISO 22964). Enterobactersakazakii считается причиной возникновения менингитов и некротических колитов у детей со смертностью на уровне 40–80%. Именно поэтому контроль наличия Enterobactersakazakii в детском питании особенно важен.

В состав хромогенной среды входят:

  • Пептонная смесь
  • Факторы роста
  • Ингибиторы грамотрицательной флоры
  • Агар
  • Хромогенный субстрат, который расщепляется ферментом Enterobactersakazakii, окрашивая колонии в синий цвет

Рис. 1. Схема работы хромогенного агара

Рис. 2. Ферментативная реакция, которая лежит в основе действия хромогенного агара для Enterobactersakazakii

Рис. 3. Чистая культура Enterobactersakazakii на хромогенном агаре производства Сonda, Испания (кат. 1446)

Таким образом, на среде возможно одновременно идентифицировать и выделить чистую колонию Enterobactersakazakii.

Культуральные и биохимические свойства возбудителей пищевых токсикоинфекции

Ферментный состав любого микроорганизма является достаточно постоянным признаком в нормальных условиях, т.е. различные виды микроорганизмов различаются по набору ферментов.

Изучение ферментного состава имеет важное значение для дифференцировки и идентификации различных микроорганизмов.

Специальные методы окраски бактерий. Наибольшее распространение нашли методы Грама и Циля-Нильсена.

Дифференцирующие методы обычно применяют для окрашивания различных морфологических структур.

Капсулы. Для окраски капсул бактерий применяют методы Хисса, Лейфсона и Антони; последний метод наиболее прост и включает окраску кристаллическим фиолетовым с последующей обработкой 20% водным раствором CuSO4.

Жгутики. Для окраски жгутиков предложены методы Лёффлера, Бейли, Грея и др. Для этих методов характерны первоначальное протравливание препарата и последующая окраска (чаще карболовый фуксин Циля).

Споры. Окраску спор бактерий проводят после предварительной обработки их стенок. Наиболее прост метод Пешкова, включающий кипячение мазка с синькой Лёффлера на предметном стекле с последующей докраской нейтральным красным. Споры окрашиваются в синий цвет, вегетативные клетки — в розовый.

Читайте также:  Симптомы аллергии на холод у взрослых: ринит, слезотечение, крапивница

Методы культивирования

При выращивании бактерий применяют стационарный способ, способ глубинного культивирования с аэрацией и метод проточных питательных сред. В соответствии со способами выращивания бактериальные культуры разделяют на периодические (при стационарном и глубинном культивировании) и непрерывные (при проточном культивировании).

Стационарный способ — наиболее часто используемый на практике. Состав сред остаётся постоянным, с ними не проводят никаких дополнительных манипуляций.

Способ глубинного культивирования применяют при промышленном выращивании бактериальной биомассы, для чего используют специальные котлы-реакторы. Они снабжены системами поддержания температуры, подачи в бульон различных питательных веществ, перемешивания биомассы и постоянной подачи кислорода. Создание аэробных условий по всей толще среды способствует протеканию энергетических процессов по аэробному пути, что способствует максимальной утилизации энергетического потенциала глюкозы и, следовательно, максимальному выходу биомассы.

Метод проточных сред (промышленный способ культивирования) позволяет постоянно поддерживать бактериальную культуру в экспоненциальной фазе роста, что достигают постоянным внесением питательных веществ и удалением определённого числа бактериальных клеток. Пребывание бактерий в экспоненциальной стадии роста обеспечивает максимальный выход различных БАВ (витамины, антибиотики и др.).

Первичная идентификация бактерий

В большинстве случаев изучение особенностей роста для первичной идентификации возбудителей проводят на колониях, выросших в течение 18-24 ч. Характер роста бактерий на различных средах может дать много полезной информации. На практике используют сравнительно небольшой набор критериев. В жидких средах обычно учитывают характер поверхностного (образование плёнки) или придонного роста (вид осадка) и общее помутнение среды. На твёрдых средах бактерии формируют колонии — изолированные структуры, образующиеся в ре зультате роста и накопления бактерий. Колонии возникают как следствие роста и размножения одной или нескольких клеток. Таким образом, пересев из колонии в дальнейшем даёт возможность оперировать с чистой культурой возбудителя. Рост бактерий на плотных средах имеет больше характерных особенностей.

Гемолиз

Некоторые бактерии выделяют гемолизины — вещества, разрушающие эритроциты. На КА их колонии окружают зоны просветления. Образование гемолизинов (и соответственно — размеры зон гемолиза) может быть вариабельным, и для адекватного определения гемолитической активности следует просматривать чашки с посевами против источника света (рис. 1-14). Активность гемолизинов может проявляться в полном или неполном разрушении эритроцитов.

α-Гемолиз. Разрушение эритроцитов может быть неполным, с сохранением клеточной стромы. Подобный феномен называют α-гемолиз. Просветление среды вокруг колоний обычно незначительно, позднее среда вокруг колоний может приобретать зеленоватую окраску.